James Watson a DNS Nobel-díjas felfedezője Az élet titka című könyvében kissé szomorúan említi meg, hogy a Humán Genom Projekt nem hozott semmilyen nagy áttörést a DNS szekvenciák felderítésének technikájában, noha a kezdetekben azt remélték, olyan termékenyítő hatása lehet a HGP-nek, mint az űrkutatásnak volt a fizikára. A sors fintora, hogy pár évvel a projekt befejezése után vált lérhetővé egy olyan technika, ami az eddigiek sokszorása növeli a DNS szekvenálás sebességéet. A technika egyes elemei már korábban is ismertek voltak, de néhány újítással most lehetővé vált a szekvenálás automatizálása és ezzel hamarosan leválthatja Sanger több mint harminc éves technikáját.
emPCR
Az eljárás első lépcsője a vizsgálandó DNS felszabdalása kisebb 100-200 nukleotid hosszúságú szakaszokra. Ezt a restrikciós endonulkeáz nevű enzimek végzik el nekünk. Ezek után fel kell szaporítani a DNS-t, amihez polimeráz láncreakció (PCR) nevű eljárást használják. A PCR elvégzéséhez azonban eddig külön kellett válogatni a DNS darabokat, amihez bektériumokban tenyésztették őket. Az új eljárás első nagy újdonsága az emulziós PCR, ami szükségtelenné teszi ezt a lépést. A DNS darabokat elsőként aprócska műgyanta gyöngyökhöz kötik, minden gyöngyhöz egyet-egyet. Majd ezeket a gyöngyöket egy olaj/víz emulzióhoz adják. Az emulzió víz része tartalmazza a PCR-hoz szükséges anyagokat és a cseppek mérete akkora, hogy egy-egy vízcseppbe csak egy-egy DNS-t tartalmazó gyöngy férjen. Ennek köszönhetően a kis vízcseppek mint aprócska különálló lombikok működnek, melyekben a többi DNS zavaró hatása nélkül játszódhatnak le a reakciók. Ezáltal az aprócska gyöngyökhöz kötve szaporíthatjuk fel tetszőleges számban a vizsgálni kívánt genom 100-200 bázis hosszúságú darabjait.
Piroszekvenálás
Az új módszer azon az elven alapul, hogy a DNS másolásakor a beépülő nukleotidról leszakad egy pirofoszfát. Ezt a pirofoszfátot jelzi a luciferáz enzim felvillanása. Az eljárás lényegét az alábi animáció ismerteti:
Ahhoz, hogy az eljárást igazán hatékonyan lehessen használni még további ötletekre is szükség volt. Az egyik, hogy száloptikai szálakból készitenek egy olyan lemezt, ami 6x/ centimérenen 1 600 000 aprócska kis mélyedést tartalmaz. A mélyedések 15 pikoliter térfogatúak és akkorák, hogy beléjük a DNS tartalmú gyöngyökből csak egy fér el. Ezekbe rakják bele a másolt DNS-t centrifugálással, majd szintén gyöngyökhöz kötve hozzáadják a további szükséges enzimeket. A másfél millió kis kémcsőben párhuzamosan zajlik le tehát a reakció és ez adja az eljárás igazi erejét. Egy reakció 10 másodperc alatt megy végbe, de még így is könnyedén meg lehet határozni 20 millió bázist egy kis lapkán 4-5 óra alatt. Az egyes felvillanásokat a száloptika egy kamerához vezeti, ami érzékeli és rögzíti a képet.
Informatika
Az eljáráshoz legalább olyan fontos volt a megfelelő informatikai rendszer kidolgozása. Olyan szoftverre volt szükseg, amely értelmezi és bázis sorrendre fordítja le a kapott képeket. Arra is szükség volt, hogy a megkapott bázissorrendeket aztán az átfedések felhasználásával egy egységes sorrá alakítsa át. A 454 eljárás egészen új távlatokat nyit meg a genomika előtt, hiszen egyetlen egyed teljes genomját is megismerhetjük baktériumok esetében 4-5 óra, eukarióták esetében pár hét alatt (összehasonlításképpen: a HGP-nek 5 évre volt szüksége az emberi DNS feltérképezéséhez). A vizsgálathoz kiindulásnak egyetlen DNS molekula is elég. Mindezzel lehetővé válik még több faj, populáció genetikai térképének elkészítése és az emberek esetében is az egyéni változatok gyors feltárása.
